本研究使用SDS-異硫氫酸胍-β-巰基乙醇DNA提取法提取鴨絨及鵝絨制品DNA，并建立鴨絨及鵝絨熒光PCR鑒定方法，通過(guò)對(duì)方法的特異性、檢出限分析，表明方法檢出限為10ng DNA（含鮭精DNA），且特異性好。通過(guò)樣品檢測(cè)試驗(yàn)表明方法穩(wěn)定，所建立的方法可作為羽絨制品傳統(tǒng)鑒定方法（顯微鏡法）的有力輔助。
關(guān)鍵詞：羽絨；鴨絨；鵝絨；DNA；熒光PCR
1 引言
羽絨是指生長(zhǎng)在鵝、鴨腹部呈蘆花朵狀的絨毛，是一種動(dòng)物性蛋白質(zhì)纖維，在羽絨、棉花、羊毛和蠶絲四大天然保暖材料中，羽絨的保暖性能最佳[1]。然而，目前市場(chǎng)上的羽絨制品價(jià)格高低懸殊，存在不少羽絨制品摻假造假現(xiàn)象[2-3]，現(xiàn)階段，羽絨市場(chǎng)存在用劣質(zhì)原料冒充、標(biāo)示的充絨量與實(shí)際不符、蓬松度不合格、清潔度不合格等問(wèn)題[4]，其中常見(jiàn)的用劣質(zhì)原料冒充的方式有：用腈綸棉制成的假羽絨制品、用原毛制作羽絨制品、用粉碎絨（飛絲）制作的羽絨制品[5]。
在檢測(cè)行業(yè)中，羽絨的鑒定主要依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 10288—2003《羽絨羽毛檢驗(yàn)方法》及行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)FZ/T 80001—2002《水洗羽毛羽絨試驗(yàn)方法》提供的方法，該方法是通過(guò)光學(xué)顯微鏡，用肉眼觀察樣品的顯微結(jié)構(gòu)，并對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)中關(guān)于鴨絨、鵝絨及其它鳥(niǎo)類(lèi)絨毛顯微特征的文字描述和圖示進(jìn)行歸類(lèi)鑒定。該方法對(duì)檢驗(yàn)人員要求高、主觀性大，容易產(chǎn)生誤判，使用的示意圖和文字描述簡(jiǎn)單，缺乏實(shí)物標(biāo)樣參照，給實(shí)際檢驗(yàn)工作帶來(lái)困難[6]。
有鑒于此，本研究開(kāi)發(fā)了鴨絨及鵝絨制品的熒光PCR鑒定方法，以期與傳統(tǒng)鑒定方法相結(jié)合，提高羽絨鑒定的客觀性和準(zhǔn)確度。
2 材料和方法
2.1 材料與試劑
2.1.1 試驗(yàn)材料
試驗(yàn)所用的鴨絨、鵝絨等制品來(lái)自市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。
2.1.2 試劑
異硫氰酸胍、聚乙烯基吡咯烷酮K-40（PVP K-40）、十二烷基硫酸鈉（SDS）、β-巰基乙醇為Amersco公司產(chǎn)品，鮭精DNA為Sigma公司產(chǎn)品，Taq酶及2×premix ExTaq酶購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司，引物及探針（表1）由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。
2.2 方法
2.2.1 DNA提取
挑取帶毛囊的羽絨，剪取毛囊部位約0.03g樣品，加入3mL 2% SDS溶液[2% SDS，50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0），20mmol/L EDTA（pH值8.0）]，65℃水浴1.5h，不時(shí)振蕩；12000r/min離心5min，取上清；加入3mL羊毛提取液[4mol/L異硫氰酸胍，0.3mol/L氯化鈉，4% PVPK-40，50mmol/L Tris·Cl（pH值8.0），20mmol/L EDTA（pH值8.0）]及60μLβ-巰基乙醇，65℃水浴4.5h，不時(shí)振蕩；12000r/min離心5min，取上清，加入等體積酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），顛倒混勻，12000r/min離心10min；取上清，加入1μL 10mg/mL鮭精DNA，1/10體積的3mol/L乙酸鈉（pH值5.2）及等體積異丙醇，－20℃沉淀過(guò)夜，12000r/min離心15min收集沉淀；小心倒去上清，用70%乙醇洗滌二次，風(fēng)干；取50μL去離子水溶解沉淀。
2.2.2 熒光PCR檢測(cè)體系建立
2.2.2.1 鴨絨、鵝絨特異性熒光引物設(shè)計(jì)
根據(jù)家鴨、番鴨、斑嘴鴨、家鵝、鴻雁、雞、家鴿、鵪鶉、北美火雞的線粒體12S rDNA全基因序列設(shè)計(jì)引物和探針，在考慮引物及探針特異性的基礎(chǔ)上，保證在引物和探針結(jié)合位點(diǎn)處，家鴨與其祖先種綠頭鴨及斑嘴鴨序列一致，家鵝與其祖先種鴻雁序列一致。
2.2.2.2 熒光PCR擴(kuò)增及結(jié)果判斷
反應(yīng)體系（20μL）：2×premix Ex Taq 10μL，上下游引物各0.2μmol/L，探針為0.1μmol/L，模板DNA為4μL。反應(yīng)程序：95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 34s，40個(gè)循環(huán)。結(jié)果判斷：Ct值≤35時(shí)，可判定結(jié)果為陽(yáng)性；Ct值>35時(shí)，可判定結(jié)果為陰性。
2.2.2.3 方法特異性和檢出限試驗(yàn)
以提取的家鴨、番鴨、鴨絨、鵝、鵝絨、雞、鵪鶉、家牛、水牛、豬、綿羊、山羊、馬、兔、小白鼠、鮭精DNA為擴(kuò)增模板，使用鴨絨、鵝絨特異性引物和探針進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，以驗(yàn)證方法的特異性；并以100ng、10ng、1ng、100pg、10pg、1pg的模板進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，以檢測(cè)方法的檢出限，每個(gè)梯度做三個(gè)平行。
2.2.3 樣品檢測(cè)
選取18個(gè)鴨絨制品，按1.2.1的步驟提取DNA，按2.2.2進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，所使用的樣品見(jiàn)表2。由于鵝絨制品較稀少，在市面上購(gòu)買(mǎi)不到鵝絨制品，樣品試驗(yàn)中不包含鵝絨制品。
3 結(jié)果
3.1 鴨絨及鵝絨制品DNA提取方法的建立由于鴨絨及鵝絨制品含肉眼可見(jiàn)明顯毛囊，試驗(yàn)中剪取鴨絨及鵝絨毛囊部位，使用SDS-異硫氰酸胍-β-疏基乙醇法[7]提取鴨絨及鵝絨DNA。所提取的DNA濃度達(dá)20ng～200ng，進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)鴨絨DNA及鵝絨DNA的Ct值分別為25和26（圖1），表明使用該方法提取的DNA質(zhì)量滿足熒光PCR要求。
3.2 方法特異性試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果，鴨絨特異性熒光引物僅能擴(kuò)增家鴨、番鴨及鴨絨DNA，與其它物種DNA無(wú)非特異性擴(kuò)增；鵝絨特異性熒光引物僅能擴(kuò)增家鵝及鵝絨DNA，與其它物種DNA無(wú)非特異性擴(kuò)增，表明所設(shè)計(jì)的引物特異性好。
3.3 方法檢出限試驗(yàn)結(jié)果
結(jié)果，使用本方法提取100%鴨絨原料及100%鵝絨原料DNA進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)時(shí)DNA檢出限為10ng（含鮭精DNA）。
3.4 樣品檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果
檢測(cè)結(jié)果表明18個(gè)鴨絨樣品均可檢出鴨DNA成分，未檢出鵝DNA成分，檢測(cè)結(jié)果與產(chǎn)品的明示成分一致（表1）。單獨(dú)使用家鴨特異性引物及番鴨特異性引物進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，18個(gè)樣品均檢出家鴨DNA成分，未檢出番鴨DNA成分，表明18個(gè)鴨絨制品均來(lái)自家鴨絨。
4 討論
動(dòng)物纖維中的DNA主要存在于毛囊部位，在毛干中也存有少量線粒體DNA[8]，由于羽絨制品含有肉眼可見(jiàn)的毛囊，試驗(yàn)過(guò)程中重點(diǎn)挑取毛囊部位，使用SDS-異硫氫酸胍-β-巰基乙醇DNA提取法[7]進(jìn)行DNA提取時(shí)，羽絨毛囊部位基本溶解，毛干產(chǎn)生大范圍斷裂，通過(guò)樣品檢測(cè)試驗(yàn)，表明該方法可成功提取鴨絨及鵝絨DNA。
本試驗(yàn)選取線粒體16S rDNA基因序列作為引物設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)時(shí)，必須考慮所設(shè)計(jì)的引物可涵蓋全世界不同鴨鵝品系。理論上，由于鴨、鵝與其祖先種的分化時(shí)間久于鴨、鵝各品系分化時(shí)間，只要某段DNA序列在鴨鵝及其祖先種中保守，則可保證在所有的馴化品系中保守，從而在理論上保證該引物可檢測(cè)所有鴨鵝品系的羽絨制品。根據(jù)維基百科和相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道[9-10]，除疣鼻棲鴨（Cairina moschata，俗稱番鴨）外，家鴨起源于河鴨屬中的綠頭野鴨（Anas Platyrhynchos）和斑嘴鴨（A. poecilorhyncha），而番鴨是由中南美洲引入的鴨種。家鵝是由雁類(lèi)野鳥(niǎo)經(jīng)人類(lèi)長(zhǎng)期馴化形成，其中中國(guó)
家鵝由鴻雁（Anser cygnoides）馴化而成，歐洲家鵝由灰雁（A.anser）馴化而成。因而，下載家鴨、番鴨、家鵝與其祖先種，同時(shí)下載相近品種進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，所設(shè)計(jì)的引物通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST比對(duì)以及特異性試驗(yàn)，表明特異性好。
羽絨纖維種類(lèi)的鑒定目前主要依靠顯微鏡法，該方法操作簡(jiǎn)單，但過(guò)分依賴試驗(yàn)人員的素質(zhì)和經(jīng)驗(yàn)，主觀性過(guò)強(qiáng)，本研究開(kāi)發(fā)的方法可作為傳統(tǒng)顯微鏡鑒定方法的有力輔助，進(jìn)一步提高羽絨鑒定的客觀性和準(zhǔn)確性。
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（文/陳國(guó)培賴心田 唐復(fù)潤(rùn) 林霖 楊友紅 楊志敏 楊國(guó)武 作者單位：深圳市計(jì)量質(zhì)量檢測(cè)研究院）
